产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的研究

【摘要】谷胱甘肽（GSH）是生物体内一种重要的含硫生物活性小分子化合物，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成，在活细胞内具有抗氧化、清除自由基、提高机体免疫力和解毒等生理功能。近年来，随着研究的不断深入，GSH在食品、保健品、医药、体育运动、动物生产等诸多领域都具有广泛的应用。全细胞生物转化具有转化效率高，催化专一性强，反应条件温和等优点，因此可以采用此法合成GSH。本论文以产朊假丝酵母（CandidautilisSZU07-01）为出发菌株，以实现GSH转化的高产量、高得率为目标进行研究，主要内容包括三个方面：首先利用基因组改组（Genomeshuffling）技术选育高性能菌株，提高其胞内GSH合成酶系的表达水平；其次应用统计学方法对微生物培养条件、转化液中各前体氨基酸的比例以及转化培养环境参数进行优化；最后考察表面活性剂对酵母细胞合成GSH能力的影响及其作用机制。主要研究结果如下：（1）对出发菌株C.utilisSZU07-01采用亚硝基胍诱变，再经过2轮Genomeshuffling递归融合，并通过选择培养基（含2.0g/L乙硫氨酸，1.2g/LNaHSO3）进行筛选，最终获得一株GSH合成能力显著提高的菌株F2-32，经过分批发酵验证，其胞内GSH含量达到2.8%，比出发菌株提高了64.2%。为下一步利用该菌株进行全细胞生物转化合成GSH奠定了良好基础。（2）采用单因素试验和响应面分析等实验设计方法，对培养F2-32的种子培养基成分进行优化，以获得最高GSH转化力为目标，得出最适的种子培养基成分为：葡萄糖58.5g/L、蛋白胨25g/L、酵母粉10g/L、KH2PO417.2g/L、MgSO4·7H2O0.05g/L和pH6.0。在该培养基条件下，GSH转化力平均为1.54mg/g/h，比营养条件优化前提高了将近1倍。其次，采用正交试验设计对转化液体系中各反应物组分进行优化，得到的最优组合是：半胱氨酸20mmol/L、谷氨酸40mmol/L、甘氨酸40mmol/L、MgCl2·6H2O40mmol/L和ATP20mmol/L，在该转化液体系下，胞内GSH产量达198.2mg/L，比优化前提高了23.0%。最后，在培养基和转化液体系优化的基础上，通过对胞内GSH合成和糖酵解过程中的关键酶以及能量代谢物质进行分析，发现葡萄糖作为能量物质代替ATP是切实可行的，转化液中葡糖糖的最适浓度为40g/L。（3）考察了六种表面活性剂在GSH转化中的作用，结果显示SDS对GSH胞外积累具有积极作用，随着SDS的增加胞外GSH含量不断上升，但GSH总量呈抛物线，当SDS添加量为0.15g/L时，胞外GSH含量为135mg/L，GSH总量达到最大为235mg/L。对SDS促进GSH胞外分泌的作用机理进行了进一步分析，采用透射电镜对不同作用时间下的细胞进行观察，发现适宜的SDS浓度可以在不破坏细胞性能的情况下增加了细胞膜的通透性。通过对胞内γ-GCS的酶活进行测定，发现适量SDS的添加提高了γ-GCS的活性，这一结果也从侧面反映了SDS的作用，即通过增加细胞膜的通透性，使GSH向胞外分泌，从而解除了胞内GSH的反馈抑制作用，增加GSH合成量。对胞内能量代谢物质水平进行分析，发现SDS对细胞的能量代谢没有显著影响。这些研究结果为进一步提高GSH生物合成能力提供了理论参考。
【作者】朱健；
【导师】卫功元；
【作者基本信息】苏州大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】产朊假丝酵母；谷胱甘肽；Genomeshuffling；全细胞转化；表面活性剂；

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